Анализ крови на цитохимию

Анализ крови на цитохимию

Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов и новообразований, пунктатов; они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ). Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 — специфическая окраска была слабой (+) и в 5 — более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60*0)+(35* 1)+(5*2)=0+35+10=45 ед.

Можно выразить результат в виде среднего цитохимического показателя по L. Kaplow (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК). С этой целью также дифференцируют 100 исследуемых клеток по указанной выше системе. Полученный процент клеток в каждой группе умножают на соответствующее данной группе число плюсов. Сумма этих величин, деленная на 100, представляет собой СЦК для одной клетки. В указанном примере СЦК щелочной фосфатазы нейтрофилов равен 0,45.

В тех случаях, когда изучаемые вещества локализуются в клетках в виде единичных гранул (например, активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах и др.), результат цитохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих положительную реакцию.

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнивать распределение исследуемых веществ в разных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при различных патологических состояниях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тяжести и в связи с проводимой терапией.

Следует иметь ввиду, что цитохимический метод может быть использован только в качестве дополнения к морфологическому исследованию, но не может его заменить. Недостатком всех цитохимических реакций является их приблизительная качественная оценка, основанная на степени интенсивности окраски.

Наиболее часто проводятся следующие цитохимические исследования:

  • определение гликогена
  • определение липидов
  • определение железа (негемоглобинового)
  • определение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК)
  • определение активности ферментов:
    • миелопероксидазы,
    • щелочной фосфатазы,
    • кислой фосфатазы,
    • цитохромоксидазы,
    • дегидрогеназ
      • сукцинатдегидрогеназы
      • альфа-глицерофосфатдегидрогеназы
    • неспецифических эстераз
      • альфа-нафтилацетат-эстеразы,
      • кислой альфа-нафтилацетат-эстеразы,
      • нафтол-AS-ацетат-эстеразы,
      • нафтол-AS-D-хлорацетат-эстеразы
  • определение катионного белка
  • тест восстановления нитросинего тетразолия.
  • Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва «Медицина» 1975 г.
  • Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва «Медицина» 1987 г.

Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов — шифф-йодная кислота).

Раздел: Цитохимия

Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта.

Раздел: Цитохимия

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Раздел: Цитохимия

Для подсчета миелокариоцитов пунктат костного мозга разводят в 200 раз. Для этого к 4 мл 3 -5% раствора уксусной кислоты добавляют 0,02 мл пунктата. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и заполняют камеру Горяева. После оседания форменных элементов (через 1 — 2 мин) подсчитывают миелокариоциты в 100 больших квадратах (аналогично подсчету числа лейкоцитов в периферической крови).

Раздел: Гемоцитология

Неорганизованные осадки мочи состоят из различных солей, органических соединений и лекарственных веществ, осевших в моче в виде кристаллов или аморфных тел. Однако чаще неорганизованный осадок состоит преимущественно из солей.

Раздел: Анализ мочи

источник

Цитохимическая характеристика элементов гемопоэза может быть проведена начиная со стадии морфологически распознаваемых пролиферирующих клеток (эритробласта, миелоб-ласта, монобласта, лимфобласта). При этом, при описании химических и энзимо-химичес-ких особенностей этого и других классов кроветворных клеток, предпочтение должно быть отдано реакциям, которые могут иметь диагностическое или дифференциально-диагности­ческое значение.

Уже в первой морфологически распознаваемой клетке гранулопоэза — миелобласте об­наруживаются все цитохимические признаки, свойственные этому ряду. В цитоплазме мие-лобластов выявляется положительная реакция при определении активности пероксидазы и хлорацетатэстеразы. При проведении PAS-реакции наблюдается диффузное окрашивание цитоплазмы, а при окраске Суданом черным В — умеренная суданофилия. В этих же клетках отмечается активность кислой фосфатазы, при выявлении которой интенсивность диффуз­ной окраски цитоплазмы колеблется от слабой до умеренной. Как и во всех пролиферирую­щих клетках гранулоцитарного ряда, в миелобластах не выявляется активность щелочной фосфатазы. Реакция при определении активности неспецифической эстеразы — слабо поло­жительная, не ингибируется фторидом натрия.

Как правило, активность разных ферментных систем, содержание гликогена и липидов увеличиваются по мере созревания клеточных элементов гранулоцитопоэза.

Нейтрофильные, эозинофильные и базофильные гранулоциты отличаются по ряду ци­тохимических признаков. В нейтрофильных палочко- и сегментоядерных лейкоцитах глико­ген выявляется в виде отдельных гранул вишневого цвета, выполняющих цитоплазму, или диффузной интенсивной окраски. В эозинофильных лейкоцитах гликоген располагается между специфическими гранулами, которые остаются неокрашенными. В базофильных гра-нулоцитах положительная PAS-реакция после предварительной обработки мазков амилазой сохраняется. Гранулы нейтрофильных лейкоцитов окрашиваются Суданом черным В в темно-серый или черный цвет. В зрелых эозинофильных гранулоцитах центральная часть су-данотрицательная, она окрашивается в желто-коричневый цвет, а периферия — суданополо-жительная. В эозинофильных миелоцитах, метамиелоцитах, палочко- и сегментоядерных лейкоцитах активность пероксидазы и кислой фосфатазы выше, чем в соответствующих ней­трофильных клетках, но зато совершенно не выявляется активность хлорацетатэстеразы и щелочной фосфатазы, которая в норме обнаруживается в 18—54 % зрелых нейтрофильных лейкоцитов периферической крови и костного мозга. В базофильных лейкоцитах также не выявляется активность этих ферментов и пероксидазы. Нейтрофильные, эозинофильные и

базофильные гранулоциты проявляют слабую или умеренную эстеразную активность при ис­пользовании в качестве субстрата а-нафтилацетата и нафтол-АБ-ацетата.

В клетках мегакариоцитарного ряда с помощью PAS-реакции выявляются многочислен­ные гранулы, окрашенные в вишнево-фиолетовый цвет. Столь же выраженную реакцию дают и тромбоциты. Контрольный тест с амилазой указывает на то, что определяемое веще­ство является гликогеном. При окраске Суданом черным В липиды в мегакариоцитах не об­наруживаются. Реакции на пероксидазу, хлорацетатэстеразу и щелочную фосфатазу дают от­рицательные результаты. Активность кислой фосфатазы, определяемая методом одновремен­ного азосочетания, в клетках мегакариоцитарного ряда и тромбоцитах умеренная; она пол­ностью подавляется при добавлении в инкубационную среду 0,05 М виннокислого калия-на­трия. Приблизительно такой же уровень активности в мегакариоцитах неспецифической эс-теразы, чувствительной к действию натрия фторида.

Наиболее характерным признаком моноцитов, как и всех клеток системы мононуклеар-ных фагоцитов, отличающим их от клеток остальных ростков кроветворения, является высо­кая активность неспецифической эстеразы, которая эффективно ингибируется при добавле­нии в инкубационную среду натрия фторида в концентрации 1,5 мг/мл (0,03М). В то же время этот ингибитор не оказывает влияния на более слабую активность этого фермента в других кроветворных клетках. В моноцитах крови умеренная и выраженная активность кис­лой фосфатазы, которая ингибируется ионами тартрата (виннокислого калия-натрия). По своей значимости в идентификации клеток системы мононуклеарных фагоцитов методика определения активности кислой фосфатазы приближается к маркерной реакции на неспеци­фическую эстеразу. В большей части моноцитов периферической крови выявляют актив­ность пероксидазы, уровень которой значительно ниже, чем в наиболее молодых клетках гранулоцитарного ряда. Для большей надежности можно использовать реакцию на выявле­ние нафтол-АБ-О-хлорацетатэстеразы. При этом в молодых и незрелых клетках нейтрофиль-ного ряда всегда фиксируют окрашивание цитоплазмы разной степени, а в моноцитах реак­ция всегда отрицательная [Глузман Д.Ф., 1978]. В моноцитах также незначительное количе­ство липидов и гликогена. По степени суданофилии моноциты значительно уступают клет­кам гранулоцитарного ряда. При PAS-реакции в цитоплазме моноцитов наблюдают диффуз­ное окрашивание или отложение мелких гранул по периферии клетки. Интенсивность ок­раски ниже, чем в зрелых гранулоцитах. Многие авторы указывают на выраженную цитохи­мическую гетерогенность этой группы клеток периферической крови [Глузман Д.Ф., 1978; Jansa, Papousek, 1971; Kaplow, 1975].

Лимфоциты — самые «бедные» в цитохимическом отношении клетки. Небольшая часть этих клеток содержит лишь выявляемые цитохимически гликоген (2—30 %), кислую фосфа­тазу и кислую а-нафтилацетатэстеразу. В них никогда не определяется активность перокси­дазы и нет липидов. Вместе с тем положительная реакция на кислую фосфатазу и кислую а-нафтилацетатэстеразу и тип реакции на эти ферменты позволяют разграничить различные виды лимфоцитов.

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой ре­зультатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени ин­тенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые клетки делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммируют и вычитают количест­во клеток без окраски, результат выражают в процентах. Например, при исследовании актив­ности миелопероксидазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток: в 2 — активность фермента не выявлена (—); в 3 — специфическая окраска была слабой (+); в 20 — более ин­тенсивной (++) и в 75 — резко положительной (+++). Результат определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах в таком случае составит: (3 + 20 + 75) — 2 = 98 %.

Результат можно выразить в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по L. Kaplow (1955). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток оп­ределенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число кле­ток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумму этих произведений делят на 100, что и составляет СЦК. Например, при исследовании активности миелопероксидазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток: в 2 активность фермента не выявлена (-); в 3 специфическая окраска была слабой (+); в 20 более интенсивной (++) и в 75 резко положительной (+++). СЦК для одной клетки в таком случае составит:

(2 ■ 0) + (3 • 1) + (20 • 2) + (75 • 3) : 100 = 2,68.

Нормы для всех цитохимических показателей клеток необходимо разрабатывать каждой ла­боратории отдельно. Это обусловлено наличием различных реактивов и степенью их чистоты.

источник

Цитохимические исследования занимают важное место в дифференциальной диагностике гемобластозов. Кроме большого теоретического значения, неоспорима их роль в уточнении различных форм лейкозов. Разработка эффективных методов дифференциальной диагностики и терапии острых лейкозов, особенно острого лимфобластного лейкоза детей, стала возможной только после введения в клиническую практику цитохимических методов диагностики.

Цитохимические исследования проводят в мазках крови, лейкоконцентрата, костного мозга. Они основаны на использовании специфических химических цветовых реакций для определения в клетках различных веществ. При цитохимическом исследовании пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип G. Astaldi (1957), основанный на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на четыре группы: с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резкоположительной (+++).

Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида и дифференцируют их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы (ед.). Активность ферментов выражают в условных единицах или в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Средний цитохимический коэффициент вычисляют по формуле Кеплоу в модификации Астальди и Верга:

где цифры (1, 2, 3, 4) обозначают интенсивность окраски; буквы (а, б, в, г) — число подсчитанных клеток с определенной интенсивностью окраски (цитохимической реакции).

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнить распределение исследуемых веществ в различных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при тех или иных патологических состояниях. Следует, однако, иметь в виду, что цитохимический метод может использоваться только в качестве дополнения к другим методам исследования — морфологическим, иммунологическим, цитогенетическим.

За счет гликогена в основном обеспечиваются энергетические потребности клеток. В частности, за счет реакций гликогенолиза образуется энергия, необходимая для осуществления функции фагоцитоза. Локализуется гликоген в цитоплазме клеток. Для цитохимического выявления гликогена чаще всего применяют PAS-реакцию, или ШИК-реакцию (по названию реактива — шифф-йодная кислота).

Положительную ШИК-реакцию могут также давать такие вещества, как гликозаминогликаны, мукополисахариды, гликопротеины, мукопротеи-ны и др. Гликоген можно легко дифференцировать от других веществ пробами со слюной или α-амилазой.

Проба со слюной . Препарат помещают в свежесобранной слюне в термостат при 37 °С на 30 мин, затем его окрашивают вышеописанной методикой. При инкубации препарата αамилаза, содержащаяся в слюне, расщепляет гликоген, и при реакции с реактивом Шиффа розовая окраска на гликоген не развивается’.

Проба с α-амилазой . Препарат помещают в раствор α-амилазы (1 мл профильтрованной амилазы растворяют в 40 мл 0,85% раствора натрия хлорида) на 30 мин в термостат при 37 °С.

Нормальные величины. В мазках периферической крови и костного мозга гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов разной степени зрелости, но преимущественно в более зрелых (в виде обильной мелкой и диффузной зернистости). В цитоплазме мегакариоцитов и тромбоцитов гликоген определяется в виде одиночных крупных зерен. В крови здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов (+++) колеблется в пределах 2–12 % от общего числа нейтрофилов, средней интенсивности окраски (++) — в пределах 72–90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей равен 1,71–2,04 (Кост Е. А., 1975), а по данным В. Б. Лецкого (1970) — 2,52. У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена до 1,98 (Германов В. А., Сергеева Т. М., 1972).

В лимфоцитах здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 10–12% клеток. В мегакариоцитах гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30–50), напоминая скопления кровяных пластинок. Число гликогенположительных мегакариоцитов составляет в среднем 60 % от общего числа мегакариоцитов.

Клиническое значение . Увеличение числа гликогенположительных лимфоцитов4 (до 70–80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно для хронического лимфолейкоза (гликоген определяется в виде крупных гранул). Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, сахарном диабете, истинной полицитемии. Уменьшение отмечается при агранулоцитозах, лучевой болезни, при хроническом миелолейкозе — примерно в 2 раза по сравнению с нормой, особенно при прогрессировании заболевания (общее количество гликогена, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышено из-за лейкоцитоза). При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено (после спленэктомии оно восстанавливается до нормальных величин).

В лейкемических клетках при остром миелобластном лейкозе гликоген или не содержится вообще, или распределен диффузно либо в виде мелкой зернистости; при остром лимфобластном лейкозе — в виде крупных гранул, расположенных в цитоплазме вокруг ядра; при остром монобластном лейкозе бластные клетки содержат незначительное количество диффузно окрашиваемого гликогена; при остром эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах.

Липиды локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Клетки костного мозга и периферической крови содержат простые липиды в виде нейтральных жиров, свободных жирных кислот, а также сложные липиды — фосфолипиды. Цитохимическое исследование основано на применении веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира применяют судан III, окрашивающий жир в оранжевый цвет. Липоиды лучше выявляются Суданом черным (черное окрашивание). В гематологических исследованиях чаще применяется окраска мазков Суданом III.

Нормальные величины. Липиды содержатся в цитоплазме нейтрофилов в виде обильной зернистости. Большинство нейтрофилов (69–80 %) у здоровых людей окрашивается интенсивно (+++), 18–36 % — дают окраску средней интенсивности (++) и 10 % — слабо окрашены (+). СЦК липидов в нейтрофилах здоровых людей равен 2,65. В меньших количествах липиды в норме обнаруживаются и в моноцитах. В миелобластах обнаружено небольшое количество липидов, в промиелоцитах их больше, и по мере созревания нейтрофилов содержание липидов увеличивается. В клетках лимфатического ряда липиды не выявляются.

Клиническое значение . Повышение СЦК липидов отмечено у лиц старческого возраста. Повышение содержания липидов в нейтрофилах наблюдается при остром миелобластном и монобластном лейкозах, при прогрессировании хронического миелолейкоза. При недифференцированном остром лейкозе бластные клетки содержат липиды в небольшом количестве (2–3 %). Уменьшение СЦК липидов отмечено при лечебном голодании. Снижение содержания липидов в нейтрофилах выявлено при ревматизме, воспалительных процессах. При остром лимфобластном лейкозе липиды в бластных клетках не выявлены.

В организме человека пероксидаза обнаружена в лейкоцитах, тромбоцитах, в молоке, а также в тканях, в которых происходит метаболизм эйкозано-идов. Простетической группой является протогем. В реакции, катализируемой пероксидазой, перекись водорода восстанавливается за счет соединений, выступающих в качестве доноров электронов, таких как аскорбат, хиноны или цитохром С. Реакция, катализируемая пероксидазой, имеет сложный характер и суммарно выглядит следующим образом:

Пероксидаза локализуется преимущественно в специфической зернистости цитоплазмы гранулоцитов, является маркером клеток миелоидной природы. Она отсутствует в лимфоидных клетках. Ввиду специфичности для нейтрофилов, начиная с ранних фаз созревания, фермент получил название миелопероксидаза. Активность пероксидазы подвержена большим колебаниям.

Нормальные величины. В крови здоровых людей активность пероксидазы выявляется преимущественно в цитоплазме гранулоцитов, в меньшей степени и непостоянно — моноцитов. Фермент появляется в клетках на стадиях промиелоцита и более зрелых миелобластов. Лимфобласты не содержат пероксидазу. 3–16% нейтрофилов окрашены резко положительно (+++), 60–90 % — положительно (++), остальные — слабоположительно (+) (Кост Е. А., 1975). СЦК пероксидазы в нейтрофилах здоровых людей равен 2,5 (Лецкий В. Б., 1970). Эозинофилы характеризуются резко положительной реакцией на пероксидазу.

Клиническое значение . В бластных клетках высока активность фермента при остром миелобластном лейкозе. У больных с хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,6; слабая активность фермента наблюдается при остром монобластном лейкозе и отсутствует при остром лимфобластном лейкозе. Определение активности миелопероксидазы как маркера миелоидного ряда используется для дифференциальной диагностики острых миелобластных и лимфобластных лейкозов. Снижение активности фермента отмечено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях.

Активность щелочной фосфатазы выявляется впервые на стадии метамиелоцита, повышается по мере дифференцировки до сегментоядерного нейтрофила, а затем по мере старения клетки вновь снижается. Активность фермента определяется в специфических гранулах цитоплазмы. Щелочная фосфатаза относится к группе гидролитических ферментов, расщепляет различные фосфорные эфиры в щелочной среде (оптимум pH 9,6), осуществляет гидролиз однозамегценных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.

Нормальные величины. У здоровых людей большинство сегментоядерных нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными, и только в 20–30 % клеток (Кост Е. А., 1975) (20–40% — по данным Л. В. Козловской и М. А. Мартыновой, 1975) выявлена слабая активность фермента (+). По данным М. Г. Шубина (1980), активность щелочной фосфатазы для здоровых лиц обоего пола составляет 26 ед., т. е. СЦК равен 0,26. Отмечена более высокая активность фермента у женщин по сравнению с мужчинами (соответственно 31,0±0,8 и 21,0±0,7 ед.).

Клиническое значение . Повышение активности фермента в цитоплазме нейтрофилов отмечается при истинной полицитемии, хроническом миелофиброзе, апластических анемиях. Увеличение активности щелочной фосфатазы в цитоплазме нейтрофилов при острых нелимфобластных лейкозах — благоприятный признак, поскольку у таких больных более вероятны ремиссии. Увеличение активности фермента выявлено у детей первого полугодия жизни— 150–159 ед. Активность фермента увеличивается при беременности, при многих воспалительных процессах, хронических заболеваниях печени, инфекциях, злокачественных новообразованиях, диабетическом кетоацидозе, приеме пероральных контрацептивов, болезни Дауна, инфаркте миокарда и др. Резкое снижение активности щелочной фосфатазы (до полного отсутствия) наблюдается при хроническом миелолейкозе, что может служить важным дополнением дифференциальной диагностики хронического миелолейкоза и хронического миелофиброза, а также лейкемоидных реакций по миелоидному типу. Снижение активности фермента наблюдается при вирусных заболеваниях, в том числе инфекционном гепатите, при лучевой болезни, серповидно-клеточной анемии, болезнях соединительной ткани.

Активность кислой фосфатазы обнаруживается преимущественно в нейтрофилах и лимфоцитах крови (максимально в нейтрофильных миелоцитах); локализацию связывают с лизосомами цитоплазмы клеток. Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом (оптимум действия при pH 5,2). Для цитохимического исследования обычно используют методы азосочетания. Нафтолфосфаты под воздействием кислой фосфатазы расщепляются с образованием свободного нафтола, который вступает в реакцию с солью диазония. В результате в местах определяемой активности фермента выпадает осадок азокрасителя красного цвета на зеленом фоне.

Нормальные величины. В клетках крови активность фермента обнаруживается в 12% зрелых гранулоцитов и в лимфоцитах. В нейтрофилах периферической крови здоровых людей активность фермента колеблется в пределах 11–72 ед., т. е. СЦК равен 0,386; в лимфоцитах— 25,0–28,8 ед., т. е. СЦК равен 0,286. У детей активность кислой фосфатазы в нейтрофилах выше, чем у взрослых.

Клиническое значение . Активность кислой фосфатазы повышается при острых лейкозах — монобластном и миелобластном, особенно при остром промиелоцитарном лейкозе (в диффузной форме), при острых лимфобластных лейкозах (в гранулярной форме). Повышение активности фермента наблюдается в нейтрофилах при воспалительных процессах (острая пневмония), туберкулезе, инфаркте миокарда, острых хирургических инфекциях, злокачественных опухолях. Повышение активности фермента в лимфоцитах отмечается при хронических тонзиллитах, при различных аллергических заболеваниях, после иммунизации.

Неспецифические эстеразы — это группа ферментов (гидролаз) с невысокой специфичностью, расщепляющих эфиры карбоновых кислот с короткой углеродной цепью. Локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в лизо-сомах. Активность этих ферментов в той или иной степени выявляется во всех видах лейкоцитов (максимально в незрелых гранулоцитах и моноцитах). Наибольшая активность обнаружена в моноцитах крови. Для определения активности ферментов используют различные субстраты (α-нафтилацетат, нафтол-AS-ацетат, нафтол-AS-D-хлорацетат и др.). Под влиянием неспецифических эстераз из субстрата освобождается свободный нафтол, который дает цветное окрашивание с солями диазония.

Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов. Ряд из них принимает непосредственное участие в процессах биологического окисления, осуществляя перенос протонов с субстрата, подвергающегося окислению, на другой субстрат. Дегидрогеназы, катализирующие такое восстановление, специфичны как к донору водорода, так и к его акцептору. Дегидрогеназы присутствуют в самых различных клетках и тканях. Они локализуются в цитоплазме и митохондриях, могут быть выявлены цитохимически при экспозиции клеток с соответствующим субстратом, на который дегидрогеназы действуют в присутствии тетразолиевых соединений, способных акцептировать протоны, с образованием нерастворимых окрашенных соединений.

Нормальные величины. У здоровых людей СДГ и α-ГФДГ выявляются в виде гранул синего цвета в нейтрофилах, лимфоцитах, тромбоцитах периферической крови и миелобластах, гранулоцитах, мегакариоцитах, эритро- и нормобластах костного мозга.

СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,10±0,05; α-ГФДГ — 0,80±0,08. У детей активность СДГ выявляется в 46 % лимфоцитов. У взрослых в пунктате костного мозга 88 % недифференцированных клеток имеют активность фермента (+), все ядросодержащие клетки эритроидного ряда и гранулоциты проявляют активность на (+) или (++).

Клиническое значение . Повышение активности СДГ и α-ГФДГ в гранулоцитах обнаружено у больных со злокачественными опухолями. Снижение активности выявляется в лимфоцитах в период приступа бронхиальной астмы, при хроническом лимфолейкозе, в гранулоцитах — при хроническом миелолейкозе.

источник

Цитохимические исследования занимают важное место в дифференциальной диагностике гемобластозов. Кроме большого теоретического значения, неоспорима их роль в уточнении различных форм лейкозов. Разработка эффективных методов дифференциальной диагностики и терапии острых лейкозов, особенно острого лимфобластного лейкоза детей, стала возможной только после введения в клиническую практику цитохимических методов диагностики.

Цитохимические исследования проводят в мазках крови, лейкоконцентрата, костного мозга. Они основаны на использовании специфических химических цветовых реакций для определения в клетках различных веществ. При цитохимическом исследовании пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип G. Astaldi (1957), основанный на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на четыре группы: с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резкоположительной (+++).

Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида и дифференцируют их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы (ед.). Активность ферментов выражают в условных единицах или в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Средний цитохимический коэффициент вычисляют по формуле Кеплоу в модификации Астальди и Верга:

где цифры (1, 2, 3, 4) обозначают интенсивность окраски; буквы (а, б, в, г) — число подсчитанных клеток с определенной интенсивностью окраски (цитохимической реакции).

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнить распределение исследуемых веществ в различных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при тех или иных патологических состояниях. Следует, однако, иметь в виду, что цитохимический метод может использоваться только в качестве дополнения к другим методам исследования — морфологическим, иммунологическим, цитогенетическим.

За счет гликогена в основном обеспечиваются энергетические потребности клеток. В частности, за счет реакций гликогенолиза образуется энергия, необходимая для осуществления функции фагоцитоза. Локализуется гликоген в цитоплазме клеток. Для цитохимического выявления гликогена чаще всего применяют PAS-реакцию, или ШИК-реакцию (по названию реактива — шифф-йодная кислота).

Положительную ШИК-реакцию могут также давать такие вещества, как гликозаминогликаны, мукополисахариды, гликопротеины, мукопротеи-ны и др. Гликоген можно легко дифференцировать от других веществ пробами со слюной или α-амилазой.

Проба со слюной . Препарат помещают в свежесобранной слюне в термостат при 37 °С на 30 мин, затем его окрашивают вышеописанной методикой. При инкубации препарата αамилаза, содержащаяся в слюне, расщепляет гликоген, и при реакции с реактивом Шиффа розовая окраска на гликоген не развивается’.

Проба с α-амилазой . Препарат помещают в раствор α-амилазы (1 мл профильтрованной амилазы растворяют в 40 мл 0,85% раствора натрия хлорида) на 30 мин в термостат при 37 °С.

Нормальные величины. В мазках периферической крови и костного мозга гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов разной степени зрелости, но преимущественно в более зрелых (в виде обильной мелкой и диффузной зернистости). В цитоплазме мегакариоцитов и тромбоцитов гликоген определяется в виде одиночных крупных зерен. В крови здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов (+++) колеблется в пределах 2–12 % от общего числа нейтрофилов, средней интенсивности окраски (++) — в пределах 72–90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей равен 1,71–2,04 (Кост Е. А., 1975), а по данным В. Б. Лецкого (1970) — 2,52. У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена до 1,98 (Германов В. А., Сергеева Т. М., 1972).

В лимфоцитах здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 10–12% клеток. В мегакариоцитах гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30–50), напоминая скопления кровяных пластинок. Число гликогенположительных мегакариоцитов составляет в среднем 60 % от общего числа мегакариоцитов.

Клиническое значение . Увеличение числа гликогенположительных лимфоцитов4 (до 70–80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно для хронического лимфолейкоза (гликоген определяется в виде крупных гранул). Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, сахарном диабете, истинной полицитемии. Уменьшение отмечается при агранулоцитозах, лучевой болезни, при хроническом миелолейкозе — примерно в 2 раза по сравнению с нормой, особенно при прогрессировании заболевания (общее количество гликогена, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышено из-за лейкоцитоза). При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено (после спленэктомии оно восстанавливается до нормальных величин).

В лейкемических клетках при остром миелобластном лейкозе гликоген или не содержится вообще, или распределен диффузно либо в виде мелкой зернистости; при остром лимфобластном лейкозе — в виде крупных гранул, расположенных в цитоплазме вокруг ядра; при остром монобластном лейкозе бластные клетки содержат незначительное количество диффузно окрашиваемого гликогена; при остром эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах.

Липиды локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Клетки костного мозга и периферической крови содержат простые липиды в виде нейтральных жиров, свободных жирных кислот, а также сложные липиды — фосфолипиды. Цитохимическое исследование основано на применении веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира применяют судан III, окрашивающий жир в оранжевый цвет. Липоиды лучше выявляются Суданом черным (черное окрашивание). В гематологических исследованиях чаще применяется окраска мазков Суданом III.

Нормальные величины. Липиды содержатся в цитоплазме нейтрофилов в виде обильной зернистости. Большинство нейтрофилов (69–80 %) у здоровых людей окрашивается интенсивно (+++), 18–36 % — дают окраску средней интенсивности (++) и 10 % — слабо окрашены (+). СЦК липидов в нейтрофилах здоровых людей равен 2,65. В меньших количествах липиды в норме обнаруживаются и в моноцитах. В миелобластах обнаружено небольшое количество липидов, в промиелоцитах их больше, и по мере созревания нейтрофилов содержание липидов увеличивается. В клетках лимфатического ряда липиды не выявляются.

Клиническое значение . Повышение СЦК липидов отмечено у лиц старческого возраста. Повышение содержания липидов в нейтрофилах наблюдается при остром миелобластном и монобластном лейкозах, при прогрессировании хронического миелолейкоза. При недифференцированном остром лейкозе бластные клетки содержат липиды в небольшом количестве (2–3 %). Уменьшение СЦК липидов отмечено при лечебном голодании. Снижение содержания липидов в нейтрофилах выявлено при ревматизме, воспалительных процессах. При остром лимфобластном лейкозе липиды в бластных клетках не выявлены.

В организме человека пероксидаза обнаружена в лейкоцитах, тромбоцитах, в молоке, а также в тканях, в которых происходит метаболизм эйкозано-идов. Простетической группой является протогем. В реакции, катализируемой пероксидазой, перекись водорода восстанавливается за счет соединений, выступающих в качестве доноров электронов, таких как аскорбат, хиноны или цитохром С. Реакция, катализируемая пероксидазой, имеет сложный характер и суммарно выглядит следующим образом:

Пероксидаза локализуется преимущественно в специфической зернистости цитоплазмы гранулоцитов, является маркером клеток миелоидной природы. Она отсутствует в лимфоидных клетках. Ввиду специфичности для нейтрофилов, начиная с ранних фаз созревания, фермент получил название миелопероксидаза. Активность пероксидазы подвержена большим колебаниям.

Нормальные величины. В крови здоровых людей активность пероксидазы выявляется преимущественно в цитоплазме гранулоцитов, в меньшей степени и непостоянно — моноцитов. Фермент появляется в клетках на стадиях промиелоцита и более зрелых миелобластов. Лимфобласты не содержат пероксидазу. 3–16% нейтрофилов окрашены резко положительно (+++), 60–90 % — положительно (++), остальные — слабоположительно (+) (Кост Е. А., 1975). СЦК пероксидазы в нейтрофилах здоровых людей равен 2,5 (Лецкий В. Б., 1970). Эозинофилы характеризуются резко положительной реакцией на пероксидазу.

Клиническое значение . В бластных клетках высока активность фермента при остром миелобластном лейкозе. У больных с хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,6; слабая активность фермента наблюдается при остром монобластном лейкозе и отсутствует при остром лимфобластном лейкозе. Определение активности миелопероксидазы как маркера миелоидного ряда используется для дифференциальной диагностики острых миелобластных и лимфобластных лейкозов. Снижение активности фермента отмечено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях.

Активность щелочной фосфатазы выявляется впервые на стадии метамиелоцита, повышается по мере дифференцировки до сегментоядерного нейтрофила, а затем по мере старения клетки вновь снижается. Активность фермента определяется в специфических гранулах цитоплазмы. Щелочная фосфатаза относится к группе гидролитических ферментов, расщепляет различные фосфорные эфиры в щелочной среде (оптимум pH 9,6), осуществляет гидролиз однозамегценных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.

Нормальные величины. У здоровых людей большинство сегментоядерных нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными, и только в 20–30 % клеток (Кост Е. А., 1975) (20–40% — по данным Л. В. Козловской и М. А. Мартыновой, 1975) выявлена слабая активность фермента (+). По данным М. Г. Шубина (1980), активность щелочной фосфатазы для здоровых лиц обоего пола составляет 26 ед., т. е. СЦК равен 0,26. Отмечена более высокая активность фермента у женщин по сравнению с мужчинами (соответственно 31,0±0,8 и 21,0±0,7 ед.).

Клиническое значение . Повышение активности фермента в цитоплазме нейтрофилов отмечается при истинной полицитемии, хроническом миелофиброзе, апластических анемиях. Увеличение активности щелочной фосфатазы в цитоплазме нейтрофилов при острых нелимфобластных лейкозах — благоприятный признак, поскольку у таких больных более вероятны ремиссии. Увеличение активности фермента выявлено у детей первого полугодия жизни— 150–159 ед. Активность фермента увеличивается при беременности, при многих воспалительных процессах, хронических заболеваниях печени, инфекциях, злокачественных новообразованиях, диабетическом кетоацидозе, приеме пероральных контрацептивов, болезни Дауна, инфаркте миокарда и др. Резкое снижение активности щелочной фосфатазы (до полного отсутствия) наблюдается при хроническом миелолейкозе, что может служить важным дополнением дифференциальной диагностики хронического миелолейкоза и хронического миелофиброза, а также лейкемоидных реакций по миелоидному типу. Снижение активности фермента наблюдается при вирусных заболеваниях, в том числе инфекционном гепатите, при лучевой болезни, серповидно-клеточной анемии, болезнях соединительной ткани.

Активность кислой фосфатазы обнаруживается преимущественно в нейтрофилах и лимфоцитах крови (максимально в нейтрофильных миелоцитах); локализацию связывают с лизосомами цитоплазмы клеток. Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом (оптимум действия при pH 5,2). Для цитохимического исследования обычно используют методы азосочетания. Нафтолфосфаты под воздействием кислой фосфатазы расщепляются с образованием свободного нафтола, который вступает в реакцию с солью диазония. В результате в местах определяемой активности фермента выпадает осадок азокрасителя красного цвета на зеленом фоне.

Нормальные величины. В клетках крови активность фермента обнаруживается в 12% зрелых гранулоцитов и в лимфоцитах. В нейтрофилах периферической крови здоровых людей активность фермента колеблется в пределах 11–72 ед., т. е. СЦК равен 0,386; в лимфоцитах— 25,0–28,8 ед., т. е. СЦК равен 0,286. У детей активность кислой фосфатазы в нейтрофилах выше, чем у взрослых.

Клиническое значение . Активность кислой фосфатазы повышается при острых лейкозах — монобластном и миелобластном, особенно при остром промиелоцитарном лейкозе (в диффузной форме), при острых лимфобластных лейкозах (в гранулярной форме). Повышение активности фермента наблюдается в нейтрофилах при воспалительных процессах (острая пневмония), туберкулезе, инфаркте миокарда, острых хирургических инфекциях, злокачественных опухолях. Повышение активности фермента в лимфоцитах отмечается при хронических тонзиллитах, при различных аллергических заболеваниях, после иммунизации.

Неспецифические эстеразы — это группа ферментов (гидролаз) с невысокой специфичностью, расщепляющих эфиры карбоновых кислот с короткой углеродной цепью. Локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в лизо-сомах. Активность этих ферментов в той или иной степени выявляется во всех видах лейкоцитов (максимально в незрелых гранулоцитах и моноцитах). Наибольшая активность обнаружена в моноцитах крови. Для определения активности ферментов используют различные субстраты (α-нафтилацетат, нафтол-AS-ацетат, нафтол-AS-D-хлорацетат и др.). Под влиянием неспецифических эстераз из субстрата освобождается свободный нафтол, который дает цветное окрашивание с солями диазония.

Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов. Ряд из них принимает непосредственное участие в процессах биологического окисления, осуществляя перенос протонов с субстрата, подвергающегося окислению, на другой субстрат. Дегидрогеназы, катализирующие такое восстановление, специфичны как к донору водорода, так и к его акцептору. Дегидрогеназы присутствуют в самых различных клетках и тканях. Они локализуются в цитоплазме и митохондриях, могут быть выявлены цитохимически при экспозиции клеток с соответствующим субстратом, на который дегидрогеназы действуют в присутствии тетразолиевых соединений, способных акцептировать протоны, с образованием нерастворимых окрашенных соединений.

Нормальные величины. У здоровых людей СДГ и α-ГФДГ выявляются в виде гранул синего цвета в нейтрофилах, лимфоцитах, тромбоцитах периферической крови и миелобластах, гранулоцитах, мегакариоцитах, эритро- и нормобластах костного мозга.

СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,10±0,05; α-ГФДГ — 0,80±0,08. У детей активность СДГ выявляется в 46 % лимфоцитов. У взрослых в пунктате костного мозга 88 % недифференцированных клеток имеют активность фермента (+), все ядросодержащие клетки эритроидного ряда и гранулоциты проявляют активность на (+) или (++).

Клиническое значение . Повышение активности СДГ и α-ГФДГ в гранулоцитах обнаружено у больных со злокачественными опухолями. Снижение активности выявляется в лимфоцитах в период приступа бронхиальной астмы, при хроническом лимфолейкозе, в гранулоцитах — при хроническом миелолейкозе.

источник

ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ — микроскопические методы исследования, позволяющие проводить анализ химического состава клетки и локализации в ней исследуемых веществ при сохранении структуры клетки. Цитохимические методы исследования широко используют в цитологии, эмбриологии, патологической анатомии, физиологии, фармакологии. Эти методы помогают определять характер, интенсивность обмена веществ в клетке, а также изучать различные специализированные функции клетки.

В отличие от гистохимических методов (см. Гистохимические методы исследования) цитохимические методы исследования применяют для анализа только отдельных клеток или их групп, причем цитохимические методы исследования обладают большей чувствительностью. От биохимических методов исследования цитохимические методы исследования отличает возможность точно определить локализацию исследуемых веществ в клетке. Цитохимический анализ, выявляя специфичность тканевых клеток, дополняет биохимические исследования.

Появление цитохимических методов исследования связано с развитием цитологии (см.), биохимии (см.), физиологии (см.), аналитической и органической химии.

Методы исследования хим. состава клетки подразделяют на физические (интерференционная, флюоресцентная и УФ-микроскопия — см. Микроскопические методы исследования) и собственно химические. Последние должны обеспечивать специфичность связывания красителя исследуемым веществом, сохранение неизменной локализации вещества в клетке в процессе подготовки и проведения исследования, окраску конечного продукта хим. реакции, сохранность структур клетки в условиях ее осуществления. Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды в клеточных структурах выявляют с помощью красителей (хромогенные агенты), избирательно связывающихся со специфическими группами этих веществ. Для повышения специфичности реакций применяют экстрагирование, блокаду или ферментативное расщепление неспецифических компонентов. Сохранение неизменной локализации анализируемого вещества достигается его фиксацией (см.). Для обеспечения сохранности структур клетки в условиях хим. реакций используют методы (в том числе методы аналитической химии), не требующие применения концентрированных кислот, щелочей, нагревания до высокой температуры и т. п.

Оценка анализируемых с помощью цитохимических методов исследования веществ может быть качественной и количественной. При качественных методах цитохимического анализа интенсивность реакции и локализация ее продукта определяются визуально, с помощью микроскопа. Качественные цитохимические реакции выявляют белки и аминокислоты клетки, различные ферменты, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, пигменты, биогенные амины и неорганические вещества.

Для гистохимического и цитохимического выявления белков используют их физико-химические и биологические свойства или проводят реакции на содержащиеся в них специфические группы и аминокислоты (см. Белки, гистохимические методы выявления в тканях). К методам, использующим физико-химические и биологические свойства белков, относятся иммуно-химические, авторадиографические методы, методы окрашивания, основанные на различии кислотно-щелочных свойств, методы, основанные на различиях в растворимости, методы ферментативного расщепления. К методам, использующим реакции на специфические группы белков, относятся методы определения белков по наличию реакционно-способных групп в аминокислотах.

В основе цитохимических методов исследования ферментов (см. Ферменты, гистохимические методы определения в тканях) лежит выявление продукта ферментативной реакции. Выявление самого ферментативного белка возможно лишь с помощью сложных иммуногистохимических методов. Цитохимическими методами в настоящее время определяют около 90 из 900 известных ферментов.

Определение нуклеиновых кислот (см. Дезоксирибонуклеиновые кислоты, гистохимические методы обнаружения в тканях; Рибонуклеиновые кислоты, гистохимические методы определения в тканях) основано на выявлении входящих в их состав различных компонентов: пуриновых и пиримидиновых оснований (по поглощению УФ-излучения), фосфорной кислоты и др.; применяют и методы специфической ферментативной и химической экстракции.

Для выявления углеводов используют методы их окисления, метахроматического окрашивания, связывания ионов металла, блокирования или превращения реакционно-способных групп, ферментативный гидролиз; применяют также методы авторадиографии и иммуногистохимии. Среди методов выявления полисахаридов центральное место занимает ШИК-реакция (см.).

Выявление липидов (см. Липиды, гистохимические методы определения в тканях) основано либо на восстановлении некоторых хим. соединений жирными кислотами, либо на использовании свойства ряда красителей лучше растворяться в жировых веществах. Для выявления отдельных видов липидов часто используют комплексы различных методов.

Цитохимическое определение пигментов связано с выявлением присутствующих в их составе различных химических групп (см. Пигменты, гистохимические методы определения в тканях).

Биогенные амины (катехоламины и индоламины) выявляют цитохимически, используя хромаффинную и аргентаффинную реакции, реакцию окрашивания и реакцию конденсации.

Определение внутриклеточной локализации неорганических веществ связано с большими трудностями из-за их низкой концентрации, хорошей растворимости и большой подвижности. Цитохимическое определение неорганических веществ основано на реакциях, продуктами которых являются лаки, хелаты, окрашенные соли, а также на реакциях замещения одного иона на другой. Применяют и методы микросжигания (см.), рентгеновского микроанализа.

Количественные методы цитохимического исследования используют для определения содержания веществ в клетке и ее структурах. Наиболее распространенным методом количественного цитохимического исследования является цитофотометрия (см.). Важную роль играет также авторадиография (см.), используемая для анализа скорости синтеза и обмена веществ в клетке, определения локализации отдельных веществ, перемещения их внутри клетки, для выявления клеток, маркированных радиоактивными изотопами и др. Для выявления локализации определенных генов в хромосомах применяют метод гибридизации нуклеиновых кислот на цитологических препаратах. На предварительно денатурированную ДНК помещают радиоактивную РНК или же одноцепочечную ДНК, соответствующую структуре гена; места гибридизации обнаруживают авторадиографически.

См. также Гистологические методы исследования, Гистохимия, Иммуноморфология, Цитохимия.

Библиогр.: Введение в количественную цитохимию, пер. с англ., под ред.В. Я. Бродского и Н. И. Полякова, М., 1969; Епифанова О. И., Терских В. В. и Захаров А. Ф. Радиоавтография, М., 1977; К о н о н-с к и й А. И. Гистохимия, Киев, 1976; Лилли Р. Д. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., М., 1969; Jlynna X. Основы гистохимии, пер. с нем., М., 1980; Методы цитологического анализа, пер. с англ., под ред. А. Л. Шабадаша, М., 1957; П и р с Э. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Принципы и методы гисто-цитохимического анализа в патологии, под ред. А. П. Авцына и др., Л., 1971, А. Н. Наровлянский, А. М. Амченкова.

источник

Наиболее широкое применение цитохимические исследования клеток крови нашли при дифференцировании различных форм острого лейкоза.

В основе цитохимических исследований клеток крови и пунктата костного мозга лежит способность некоторых веществ и ферментов вступать в реакцию с некоторыми красителями, давая специфическое окрашивание. По присутствию в клетке исследуемого вещества, степени активности определенного фермента позволяют делать определенные диагностические выводы о принадлежности клеток к тому или иному ростку.

Возможность проведения цитохимической характеристики элементов гемопоэза возможно только с момента морфологически распознаваемых пролиферирующих клеток — это стадия образования эритробластов, миелобластов, монобластов, лимфобластов. Предпочтение отдается реакциям, имеющим диагностическое или дифференциально-диагностическое значение.

Первой морфологически распознаваемой клеткой гранулопоэза является миелобласт, в котором можно обнаружить все цитохимические признаки, присущие этому ряду:

  • при определении активности пероксидазы и хлорацетатэстеразы в цитоплазме миелобластов выявляется положительная реакция;
  • PAS-реакция дает диффузное окрашивание цитоплазмы;
  • окрашивание суданом черным В дает умеренную суданофилию;
  • интенсивность диффузной окраски цитоплазмы миелобластов при выявлении активности кислой фосфатазы колеблется от слабой до умеренной;
  • в миелобластах не выявляется активность щелочной фосфатазы (как и во всех пролиферирующих клетках гранулоцитарного ряда);
  • реакция при определении активности неспецифической эстеразы слабо положительная и не ингибируется фторидом натрия.

По мере созревания клеточных элементов гранулоцитопоэза активность различных ферментных систем, а также содержание гликогена и липидов возрастают.

Наиболее бедными в цитохимическом отношении клетками являются лимфоциты. Только небольшая часть лимфоцитов содержит выявляемый гликоген, кислую фосфатазу и кислую альфа-нафтилацетатэстеразу, что дает возможность разграничить различные виды лимфоцитов. В лимфоцитах никогда не определяется активность пероксидазы, также нет липидов.

При цитохимическом исследовании принято пользоваться полуколичественной оценкой результатов (принцип Астальди), которая основана на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски:

  • (-) — отрицательная реакция;
  • (+) — слабоположительная реакция;
  • (++) — положительная реакция;
  • (+++) — резко положительная реакция.

Чтобы выразить результаты количественно, подсчитывается 100 клеток определенного вида, при этом проводится их дифференциация по степени интенсивности окраски. После этого количество клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммируется и из полученного числа вычитается количество клеток, которые не имеют окраски. Результат выражается в процентах.

Например, в 100 просмотренных клетках обнаружено: (-) — 5; (+) — 10; (++) — 30; (+++) — 55. Результат определения активности составит (10+30+55)-5=90%.

Результат можно выражать в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для этого опять же подсчитывается 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски. После этого количество клеток с одинаковой степенью окраски умножается на число плюсов, соответствующих этой группе и все суммируется, после чего делится на 100.

Для предыдущего примера СЦК = (5·0)+(10·1)+(30·2)+(55·3)/100 = 2,35

Следует сказать, что нормы для цитохимических показателей клеток должны разрабатываться индивидуально для каждой отдельно взятой лаборатории в зависимости от наличия реактивов и степени их чистоты.

Цитохимические особенности бластов, лежащие в основе дифференциальной диагностики острых лейкозов:

Форма острого лейкоза Пероксидаза Липиды PAS-реакция Неспецифическая эстераза Хлорацетат-эстераза Кислая фосфатаза
Недифференцируемый лейкоз (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Лимфобластный лейкоз (-) (-) (++) крупногранулярная (±) не ингибируется NaF (-) иногда (++) диффузная
Миелобластный лейкоз (++) (++) (++) диффузная (+) не ингибируется NaF (++) (++)
Миеломонобластный лейкоз (+) (+) (++) мелкогранулярная (+++) не ингибируется NaF (-) (+++)
Монобластный лейкоз (±) (±) (+) мелкогранулярная (+++) ингибируется NaF (-) (+++)
Промиелоцитарный лейкоз (+++) (+++) (+++) (+++) не ингибируется NaF (+++) (+++)
Эритромиелоз (бластные клетки) (++) (++) (++) диффузная (+) (++) (++)
Эритромиелоз (эритронормобласты) (-) (-) (++) диффузная или крупногранулярная (++) (-) (++)

ВНИМАНИЕ! Приведенная на данном сайте информация носит справочный характер. Ставить диагноз и назначать лечение может только врач-специалист в конкретной области.

источник

  • A08 Тип — морфологические исследования тканей
  • A08.05 Тип — морфологические исследования тканей. Раздел — Система органов кроветворения и кровь
  • A08.05.013 Цитохимическое исследование препарата крови (Выбранный код из номенклатуры мед. услуг )
  • Подразделы:
  • A08.05.013.001 Определение активности лактатдегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.002 Определение активности малатдегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.003 Определение активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.004 Определение активности глутаматдегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.005 Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.006 Определение активности кислой фосфатазы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.007 Определение активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.008 Определение активности НАДН-дегидрогеназы лимфоцитов в периферической крови
  • A08.05.013.009 Определение содержания гликогена в лейкоцитах
  • A08.05.013.010 Определение активности щелочной фосфатаза нейтрофилов периферической крови
  • A08.05.013.011 Определение активности системы пероксидаза-пероксид водорода нейтрофилов периферической крови
  • Смежные коды:
  • A08.05.001 Цитологическое исследование мазка костного мозга (миелограмма)
  • A08.05.002 Патолого-анатомическое исследование биопсийного (операционного) материала костного мозга
  • A08.05.006 Соотношение лейкоцитов в крови (подсчет формулы крови)
  • A08.05.012 Цитохимическое исследование микропрепарата костного мозга
  • A08.05.014 Иммуноцитохимическое исследование с моноклональными антителами материала на антигены дифференцировки лимфоидных клеток (CD)
  • A08.05.017 Цитологическое исследование отпечатков трепанобиоптата костного мозга
  • A08.05.018 Иммунофенотипирование гемопоэтических клеток-предшественниц в костном мозге
  • A08.05.019 Подсчет Т-клеток и НК-клеток в лейкоконцентрате
Расшифровка кода медицинской услуги: A 08 . 05 . 013
Класс медицинской услуги: A Медицинские услуги, представляющие собой определенные виды медицинских вмешательств, направленные на профилактику, диагностику и лечение заболеваний, медицинскую реабилитацию и имеющие самостоятельное законченное значение
Раздел медицинской услуги: 08 Морфологические исследования тканей
Анатомо-функциоанльная область 05 Система органов кроветворения и кровь
Вид медицинской услуги, имеющий законченное диагностическое или лечебное значение 013 Цитохимическое исследование препарата крови

А/B ХХ.ХХХ.ХХХ.XXX
↑ ↑ ↑ ↑ ↑
| | | | |______ порядковый номер подгруппы
| | | |______________ порядковый номер группы
| | |_______________________ подраздел медицинской услуги
| |_____________________________ раздел медицинской услуги
|___________________________________ класс медицинской услуги

Код услуги состоит из буквенно-цифрового шифра от 8 до 11 (12*) знаков.
Первый знак обозначает класс услуги, второй и третий знаки — раздел (тип медицинской услуги), четвертый и пятый (шестой*) знаки — подраздел (анатомо-функциональная область и/или перечень медицинских специальностей), с шестого по одиннадцатый знаки (с седьмого по двенадцатый*) — порядковый номер (группы, подгруппы).

3. Перечень медицинских услуг разделен на два класса: «А» и «В», построенные по иерархическому принципу (описание выше).

источник



Источник: art-mylife.ru


Добавить комментарий